食源性肽具有非常明显的降脂效应，药效持续长，副作用小且获取来源广泛。现已从乳清、大豆、大米、沙丁鱼、牡蛎以及小球藻等蛋白源的水解产物中分离出了多种降脂肽。小球藻是一类普生性单细胞微藻，属于绿藻门、绿藻纲、绿球藻目、卵囊藻科、小球藻属，生态分布极广，生长速率快，易于培养，应用价值高，可作为理想的保健食品和预防或辅助药物，己被联合国粮食及农业组织（FAO）列为21世纪人类的健康食品。我国于60年代开始大规模养殖小球藻，以蛋白核小球藻、普通小球藻和椭圆小球藻较为常见。蛋白核小球藻中含有大量蛋白质和叶绿素，含量分别高达其干质量的42%～58%和3%～5%，其氨基酸组成高于世界卫生组织和FAO颁布的用于人类营养的蛋白质标准，是一种食用安全的优质蛋白质资源，2012年我国卫生部将其列为新资源食品。以小球藻蛋白为载体，酶解制备活性肽，将会最大限度挖掘肽生物活性的多样性，从而开发具有新颖结构和功能的活性肽产品。
福建农林大学食品科学学院的林娈、刘斌*、赵超*等以蛋白核小球藻为原料，通过前期酶解工艺优化制备小球藻蛋白酶解物，采用超滤和葡聚糖凝胶对其进行分离纯化，以胰脂肪酶活性抑制率为指标筛选具有降脂活性的肽组分（记为PES），以高糖饮食秀丽隐杆线虫为模型评价纯化肽PES的降脂效果。采用LC-MS/MS鉴定PES肽序列，结合分子对接技术筛选出潜在的胰脂肪酶抑制肽并初步研究其抑制机制，为深入理解蛋白核小球藻及其他微藻蛋白肽调节脂代谢或抑制肥胖功能提供理论依照，同时有助于利用蛋白核小球藻资源开发安全高效的胰脂肪酶抑制肽，促进小球藻产业的发展。
如表2所示，将小球藻蛋白酶解物（PE）按分子质量大小可分为6 个部分，小于5 000 Da的肽段含量总和达到98.16%，其中180～1 000 Da的肽段比较集中，含量约为51.97%，还有31.86%的组分为游离氨基酸和氨基酸残基。由于组成多肽的氨基酸残基平均相对分子质量约为110 Da ，因此预测组成PE的多肽大多是由少于10 个氨基酸组成的肽段。2～6 个氨基酸组成的小肽将有利于提升肽类药物在靶组织中的稳定性、转运效率和生物利用度。
由图1可知，在8 mg/mL质量浓度下观察PE及各个组分对胰脂肪酶活性的抑制作用，＜5 kDa组分对胰脂肪酶活性抑制率最高（（45.44±3.52）%），显著（
P＜0.05）高于PE和其他2 个组分，与奥利司他（8 μg/mL）没有显著差异（P＞0.05）。因此，选择＜5 kDa组分进一步分离纯化。
如图2所示，＜5 kDa组分经Sephadex G-25分离后得到2 个主峰（F1、F2）。根据凝胶柱分离原理可知F1分子质量大于F2，且F2的相对含量更高，这与前面PE分子质量分布测定结果一致。由图3可知，F1和F2均表现出一定的胰脂肪酶抑制活性，在8 mg/mL质量浓度下F2对胰脂肪酶活性抑制率显著（
P＜0.05）高于F1，达到（42.33±0.61）%。分子质量是影响蛋白质水解物或肽生物利用度的主要的因素，因此确定分子质量较小且抑制率较高的主峰F2为蛋白核小球藻胰脂肪酶抑制肽（PES），作为进一步研究对象。
如图4所示，高脂模型组线虫虫体颜色整体较深，纯化肽PES各剂量组虫体颜色随质量浓度增大而逐渐变浅，在高剂量组中表现显而易见，高剂量组虫体颜色介于正常对照组与阳性对照组之间。 通过对 各 组虫体染料的定量分析，可以反映油红O染色处理的吸光度与脂肪含量的关系，吸光度越大说明体内脂肪沉积越多 。 由图5可知，高脂模型组线虫体内脂肪沉积量显著（
P＜0.05）高于正常对照组，说明使用含10 mmol/L葡萄糖NGM培养的Celegans能够诱导脂肪过度生成。 在高剂量1 mg/mL时，纯化肽PES对线虫体内的降脂效果最佳，其脂肪沉积量比高脂模型组低22.5%，与阳性对照组无显著差异（P＞0.05）。
由图6可见，高脂模型组线虫体内甘油三酯、总胆固醇含量均明显高于正常对照组（
P＜0.05），说明使用含10 mmol/L葡萄糖的NGM培养Celegans成功构建Celegans高脂模型。纯化肽PES各剂量组线虫的甘油三酯含量均明显低于高脂模型组（P＜0.05），与阳性对照组差异不显著（P＞0.05），各剂量组之间差异不显著（P＞0.05）。纯化肽PES各剂量组线虫的总胆固醇含量均明显低于高脂模型组（P＜0.05），与阳性对照组差异不显著（P＞0.05），中剂量组、高剂量组与正常对照组之间差异不显著（P＞0.05）。总的来看，纯化肽PES具有较好的降脂能力，质量浓度为1 mg/mL时能够降低高脂模型组线%总胆固醇水平，改善高糖饮食线虫的脂代谢紊乱。
总离子流色谱图见图7，鉴定得到999 条肽段，来源于64 种小球藻蛋白。结果显示，999 条肽段中五肽的相对含量总和达到72%，六肽的相对含量总和达到23%，七肽及7 个氨基酸以上组成的肽段仅占5%，且相对分子质量在400～700 Da之间的肽段相对含量总和占比89.7%，其中肽段FLGPF的相对含量最高（图8），单个肽占比高达7.9%。有关研究表明当多肽药物分子质量超过700 Da时，其生物利用度将随分子质量增加而显著下降，而分子质量小于500 Da的小肽（2～6 个氨基酸）具有最高的生物利用度。因此，以5～6 个氨基酸组成的肽段为主要研究对象，选取相对含量及图谱鉴定可信度较高的10 条肽段，按相对含量从高到低排序（表3），进入下一步分析。
采用MOE软件进行对接，将10 条肽段与PTL蛋白受体对接能绝对值由大到小排列，如表4所示。对接能绝对值越高，说明该分子与受体的结合亲和力越强。因此，可以认为HMPALV（-10.32 kcal/mol）、VPIIMH（-10.01 kcal/mol）、FLSQPF（-9.94 kcal/mol）、LLAPY（-9.60 kcal/mol）和FLGPF（-9.39 kcal/mol）肽段可能具有较强的抑制胰脂肪酶活性能力，用于下一步合成和活性验证。
采用Fmoc固相合成法制备HMPALV、VPIIMH、FLSQPF、LLAPY和FLGPF五条肽段，如图9所示，在1 mg/mL质量浓度时HMPALV对胰脂肪酶活性抑制率最低，FLGPF的抑制率最高。通过查看5 个肽段与酶蛋白的结合模式，发现虽然HMPALV对接能绝对值较高，但并不是在胰脂肪酶靶点上结合，所以没有起到良好的抑制作用。将VPIIMH、FLSQPF、LLAPY和FLGPF这4 条肽段序列与活性肽数据库（BioPepDB、DFBP和EROP-Moscow）中现存数据来进行比较，未曾发现相同的降脂肽序列，表明发现新的胰脂肪酶抑制肽，这为蛋白核小球藻在降脂方面的应用提供新的参考依据。
如图10所示，测定了不同质量浓度下FLGPF的胰脂肪酶活性抑制率，使用奥利司他（8 μg/mL）作为阳性对照。能够准确的看出FLGPF的胰脂肪酶活性抑制率呈现出一定的剂量依赖性增加，在质量浓度为4 mg/mL和8 mg/mL时，对胰脂肪酶活性抑制率分别达到（38.39±3.47）%和（50.12±0.84）%，与从红小豆中筛选得到的一种抗肥胖十三肽FDTGSSFYNKPAG在4 mg/mL时的胰脂肪酶抑制率（36.28%） 接近。
由图11可知，抑制剂组和无抑制剂组拟合得到的曲线 mg/mL的FLGPF后，曲线斜率降低，说明FLGPF对胰脂肪酶的抑制作用类型为可逆抑制。FLGPF通过非共价键与酶和（或）酶-底物复合物进行可逆性地结合使酶活性降低或失活，影响酶催化效率。
由图12可知，在底物浓度1～8 mmol/L范围内，通过绘制添加1、2 mg/mL抑制剂组和无抑制剂组的Lineweaver-Burk曲线 条曲线相交于横轴，此时
Km 不变，Vmax 变小，且Vmax 随抑制剂质量浓度的增加而减小，表明FLGPF对胰脂肪酶的抑制作用类型为非竞争性抑制，其抑制作用不会随底物浓度增加而减弱，该特性比竞争性抑制剂更加有助于控制餐后血脂的增高。
k）为纵坐标，抑制剂质量浓度为横坐标，进行二次作图绘制（图13）可计算得到FLGPF对胰脂肪酶的抑制常数Ki 为5.23 mg/mL。
为进一步明确FLGPF与胰脂肪酶的作用模式，进行分子对接（图14），FLGPF与PTL蛋白的结合位点形成了合适的空间互补。FLGPF的Phe1主链上—NH 3＋ 基团上的氢作为氢键供体，与PTL蛋白的Arg79侧链的氧原子形成氢键作用。FLGPF的Phe1主链上的—NH 3＋ 基团与PTL蛋白Trp252的苯环形成π-阳离子作用。FLGPF的Phe5主链上—NH 3＋ 基团上的氢与PTL蛋白Tyr114的苯环形成π-氢键作用。FLGPF与PTL蛋白也存在范德华力。相关研究发现底物（脂类）与胰脂肪酶活性中心催化位点Ser152、His263、Asp176相结合，而分子对接结果为FLGPF与酶催化活性中心之外的位点Arg79、Trp252、Tyr114相结合，符合非竞争性抑制作用特征，此结果与图12所示的抑制动力学结果一致。
此研究以蛋白核小球藻为原料，深入分析分离得到纯化肽（PES）的降脂效果，筛选出FLGPF、VPIIMH、LLAPY和FLSQPF 4 条新的胰脂肪酶抑制肽。根据结果得出，PES具有较好的降脂活性，能够有效抑制高糖饮食线虫体内的脂肪沉积，明显降低甘油三酯和总胆固醇水平。鉴定得到的短肽FLGPF为一种可逆非竞争性抑制的胰脂肪酶抑制肽，但其相关作用机制尚未明确，后期将从秀丽线虫脂代谢通路出发（如TGF-β和胰岛素代谢通路、sbp-1/mdt-15介导的固醇反应元件结合蛋白代谢通路、nhr-49介导的核激素信号通路、5-羟色胺（tph-1）介导的信号通路等），明确关键作用靶点，进一步探明其降脂作用机理。本研究可为小球藻降脂活性肽的开发提供理论参考。
刘斌，1969年6月生，教授,博士，博士生导师，现任国家菌草工程技术研究中心副主任，国家保健食品审评专家，全国工具酶标准化工作组委员，福建省健康工程学会副会长，福建省微生物学会微生物组与益生菌专业委员会主任委员，福州海洋研究院海洋食品研发中心主任， Triends in food science and technology、Marine drugs、Food & Function、Journal of Functional Foods等10多个国际期刊审稿专家。主要是做基于现代组学技术的食品功能效果成分介导肠道菌群对糖脂肝代谢调控作用及其机制研究，海源与陆源复方营养保健食品的研究与开发；曾先后主持参与国家自然科学基金、国家重点研发计划、省重大专项等省部级课题20多项，近年来在 Nature，Cell Research, Biosensors and Bioelectronics，Triends in food science and technology、Marine drugs、Journal of Functional Foods等国际SCI刊物上发表高水平论文70多篇，主编高校教材《食品微生物检验》1 部，申请发明专利60多项，其中30多项发明专利取得授权，其中10 项专利已转让应用；被评为“金山学者”创新人才，厦门市“双百人才”；获福建省教学成果奖一等奖1 项（排名第二）、福建省科学技术进步一等奖1 项（排名第三）、获神农中华农业科技奖二等奖1 项（排名第二）、福建省科技进步奖二等奖1 项（排名第一）。
赵超，教授，海西工业技术研究院农产品加工与食品安全工程技术研究中心主任、闽台特色海洋食品加工及营养健康教育部工程研究中心副主任。西班牙维戈大学科学学院兼职博导、美国加利福尼亚大学戴维斯分校访问副研究员、澳门大学中华医药研究院兼职研究人员，连续入选全球前2%顶级科学家榜单。福建省杰出青年基金获得者，省第一批“雏鹰计划”青年拔尖人才、百千万人才工程省级人选。兼任中国生物化学与分子生物学会农学分会青委会副主任、中国农业生物技术学会微生物生物技术分会理事、全国工具酶标准化工作组委员。国际期刊 eFood主编、 Journal of Advanced Research副主编，Aging and Disease、Food Frontiers青年编委。主持国家级、部省级项目15项；发表学术论文200余篇、以第一或通信作者发表SCI论文100余篇、ESI高被引10 篇，被引次数超过4500次、 H指数40；授权国家发明专利41 件、转让13 件，出版学术专著2 部，获福建省科学技术进步二等奖1 项。
本文《蛋白核小球藻胰脂肪酶抑制肽的分离纯化、 鉴定及其降脂活性》来源于《食品科学》2023年44卷24期155-163页. 作者： 林娈，柳雯郡 ，黄俊媛 ，贾瑷菁 ，汪登谜 ，刘斌*，赵超*.DOI:10.7506/spkx0302-021. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：栾文莉；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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